گزارش کارورزی ..خالص سازی فیتوپلانکتون ها...

                            گزارش کارورزی  در مرکز تحقیقات اب های دور چابهار:

                                            موضوع:خالص سازی فیتوپلانکتون ها

                                                 استاد راهنما:خانم دکتر عطاران

 

                                             دانشجو:زهره محمدرضایی کله مسیحی

                                                 شماره دانشجویی:86186039

             دانشجوی رشته مهندسی منابع طبیعی-شیلات گرایش فراوری محصولات شیلاتی86

  

مقدمه :

پلانکتون ها به عنوان غذای مهمی در رشد و نگهداری , تولید مثل, مقاومت و سلامت موجود زنده را به عهده دارد .امروزه بسیاری از دانشمندان براین عقیده اند که: اگر تغذیه یک موجود زنده بخوبی انجام گیرد و محیط مناسبی داشته باشد, مشکلاتی از نظر عدم رشد و بیماری ها بروز نخواهد کرد و تولیدات مناسبی عرضه خواهد شد.

ابزیان در دوران پرورش بخصوص در مراحل اولیه لاروی احتیاج مبرم به غذای زنده طبیعی دارند تا بتوانند ار نظر تولید رشد و نمو بافته و نیز فعالیت های تولید مثلی رشد و نمو کامل داشته باشند.

در امر کشت و پرورش توده ای (Mass culture)که در مقیاس وسیع و در تغذیه جانوران انجام می گیرد . تکنیک های مختلف موردنیاز است .در حال حاضر در ژاپن تغذیه مصنوعی میگوها و چندین گونه از دو کفه ایها در مقیاس وسیع تری بطور موفقیت امیز انجام شده است.

در این متن اطلاعاتی عملی و اساسی روس های کشت وپرورش انواع محیط های کشت و پرورش گونه های مختلف فیتوپلانکتون ها از قبیل کیتوسروس , اسکلتونما , تتذراسلمیس و کلرولا امده است.

شبکه ی غذایی دریایی و مصبی ,به انرژی پلانکتون بستگی و ارتباط دارد.موجودات شگفت انگیزی چون برخی دلفین ها ,وال ها ودیگر پستانداران دریایی,گله های کوسه و اویسترهای گفزی منطقه ی جزر ومدی ,به طور مستقیم یا غیر مستقیم به پلانکتون ها احتیاج دارندتا نیاز غذایی خود را برطرف کنند.

 بخش اول:

عوامل موثر در کشت پلانکتون ها:

عوامل مختلفی در تولید جلبک دخالت دارد که مهمترین انها عبارتند از:

1-عوامل فیزیکی شامل نور,شوری,دما,شفافیت, PHاب و .. می باشد.

نور :به عنوان منبع تولید انرژی در گیاهان شناخته شده است و در تولید جلبک نیز از دو منبع تولید نور جهت شکوفایی جلبکی استفاده می شود که عبارتند از :

الف)منبع نور مصنوعی

ب)منبع نور طبیعی(نور خورشید)

امروزه در طراحی محیط داخلی کشت جلبک تا حجم 300 لیتری از لامپ های فلوروسنت استفاده می شود,شدت نور در حدود 5000-1000 لوکس با استفاده از 3-1 رشته لامپ تنظیم می گردد و مدت نوردهی کشتها با توجه به نوع جلبک از 72-24 ساعت متغیر می باشد.

باید توجه داشت که نور شدید و زیاد نیز باعث افزایش سرعت رشد جلبک ها و در نتیجه خرابی انها در مدتی کوتاه می شود .

دما:دما هم به عنوان عامل مهمی در سرعت رشد جلبک ها مطرح است ,اصولا تجربه ثابت گردیده که در دمای 29-26 درجه سانتیگراد بهترین حالت رشد جلبکی وجود دارد و شکوفایی در حدود 36-28 ساعت رخ می دهد .در دمای پایین تر رشد جلبکی کاهش یافته و حتی مدت شکوفایی در در دمای پایین تر از 20 درجه  سانتیگراد به 4-3 روز می رسدو همچنین در دمای 32 درجه سانتیگراد به بالا نیز در مواردی خرابی سلولی و رسوب کشتها اتفاق افتاده است.

کیفیت اب:اب بطور کلی در بر گیرنده کلیه مشخصات فیزیکی, شیمیایی و میکروبی می باشد. .

PH اب:PH  اب یک عامل مهم است و pHاب بین 5/8-5/7 جهت کشت پلانکتون ها مطلوب است.

شوری :شوری مطلوب جهت کشت پلانکتون ها  PPT32-25می باشد. سوری را می توان با افزودن اب شیرین به اب دریا تنظیم کنیم.

شفافیت اب:اب مورد استفاده برای کشت پلانکتون ها باید عاری از هر گونه ذرات معلق بوده و کاملا صاف و شفاف باشد.

2-عوامل شیمیایی:

علاوه بر عوامل فیزیکی ,وضیعت شیمیایی محلول نقش مهمی در تعیین درجه رشد و کیفیت الگها دارد .بیشتر میکروالگها از نوع اوکسوتروفیک(Axotrophic)هستند.یعنی احتیاج به برخی ویتامین ها دارند.الگهای اوکسوتروفیک قادر به سنتز ویتامین های ضروری نیستند لذا ویتامین ها را باید از محیط ابی جذب نمایند.ویتامی های اصلی که مورد نیاز الگها تشخیص داده شده اند عبارتند از:B12,B1 و بیوتین.

مواد معدنی اصلی برای بسیاری از گونه های فیتوپلانکتون ها شامل نیتروژن,فسفر,پتاسیم,کلسیم,سولفور,اهن,مس,منگنز,روی,کبالت,کلر,بر و ید هستند که از انها نیتروژن,فسفر,منیزیم,اهن,مس,منگنزو روی برای همه الگها ضروری و بقیه مواد اختصاصی بعضی از گونه های الگها میباشند.

 وسایل مورد نیاز برای کشت و پرورش پلانکتون ها:

در پرورش پلانکتون ها بسیاری از وسایل مورد نیاز برای کشت و پرورش ممکن است بصورت ساده ای تهیه شوند,که عبارتند از:

دستگاه اون,اتوکلاو,دستگاه اب مقطرگیری ,ارلن مایر 2-1 لیتری,لوله ازمایش,بشر,پیپت,پیست,پتری دیش سردار,ظروف 20 لیتری,تانک های 300 لیتری,یک تا ده تنی,چراغ الکلی,قطره چکان,لام خماسیومتر,کیت کلرسنج,برس شیشه شو,ترازوی دیجیتالی با دقت01 /0گرم,هیتر برقی,قیف شیشه ای,مواد شیمیایی و....

 

اماده سازی و ضدعفونی کردن اب :

برای ضدعفونی کردن اب دو هدف مورد نیاز می باشد که عبارتند از:

1-استریل کردن یعنی از بین بردن باکتری ها,قارچها,پروتوزواهاو جلبکهای موجود در اب.

2-تصفیه اب جهت گرفتن مواد معلق در اب ,برای رسیدن به اهداف فوق به ترتیب زیر عمل می نماییم.

اب دریا را بوسیله پمپ با استفاده از لوله پلی اتیلنی به استخر رزرواسیون وارد می شود .در استخر جهت بدست اوردن شوری مناسب (PPT25)مقداری اب شیرین اضافه کرده و انها را کاملا با هم مخلوط می کنیم تا شوری در تمام سطوح اب یکسان شود.اب میکس شده در این استخر توسط پمپ از فیلتر شنی به استخر دیگری انتقال داده می شود و با استفاده از فیلتر بگ عبور داده و مورد استفاده قرار می گیرد.

انواع محیط کشت:

1-محیط کشت F2: 

-محیط کشت F2S: 

این نوع  محیط کشت هم مانند محیط کشت F2 می باشد با این تفاوت که به ان مقداری سیلیس Si افزوده می شود.

 

شناسایی گونه ها:

عمده موجودات زنده ای که در تغذیه ابزان کاربرد داند در چارت زیر مشخص شده اند.

                                       غذای زنده

                           گیاهی                 جانوری

 

              گیاهان عالی      فیتوپلانکتونها

 

                         جلبکها                                دیاتومه ها

 

کلرلا    تتراسلمیس    اسپیرلینا                             اسکلتونما        کیتوسروس

 

 

اهمیت غذای زنده در ابزی پروری :

1-     غذای زنده ساعت ها و حتی روزها پس از اینکه به اب مخازن وارد می شوند,زنده می مانند.از این رو به عنوان بستری مناسب برای رشد عوامل میکروبی مطرح نخواهد بود.

2-     به دلیل خود هضمی (Autolysis),غذای زنده هضم سریع تری دارد.

3-     امکان بهبود کیفیت مواد غذایی زنده با بکار بردن مکمل های رشد و ویتامین ها در اب محیط پرورش انها امکانپذیر است.

4-     از مواد غذایی زنده می توان به عنوان ناقل دارویی و با ترکیبات خاص مغذی استفاده نمود.

5-     غذای زنده عمدتا به صورت پلانکتونیک بوده و در اب به حالت معلق قرار می گیرد و به راحتی قابل دسترس برای ابزی می باشد.

6-     بعضی از گونه های ابزیان (مخصوصا  ماهیان دریایی)نمی توانند از غذای کنسانتره  در پره ای از مراحل لاروی خود تغذیه نماید.

7-     در بعضی از موارد استفاده از غذای زنده هزینه کمتری را برای تولید کننده در بردارد.

 

مشخصات فیتوپلانکتون ها:

-اندازه کوچک و کشیده شدن از یک سو به سوی دیگر با حرکت جریان های ابی

-وجود کلروفیل در سلول

-کلروفیل به رنگ سبز ولی در بعضی گونه ها به رنگ قهوه ای ,زرد و یا زردطلایی نیز ظاهر می شود.

-اغلب تک سلولی و بصورت منفرد که در بعضی از حالات تشکیل کلنی می دهد .

-تگثیر از طریق تقسیم سلولی

-زندگی در محیطی که نور بصورت موثر در اب نفوذ کند.

-موجودات اتوتروف اب محسوب می شوند.

-در اب راکد به جز تعداد محدودی که دارای تاژک های مخصوصی می باشند,حرکتی ندارند.

 

رشد فیتوپلانکتون ها:

-در واقع افزا یش ابعاد و وزن سلول فیتوپلانکتونها قابل اندازه گیری نیست و لذا در بیولوژی زمانی که صحبت از رشد فیتوپلانکتون ها به میان می اید ,افزایش تعداد سلولها (تراکم سلولی در واحد)حجم اب است.

-رشد و ازدیاد فیتوپلانکتون ها به شدت به دمای اب ,طول مدت تابش خورشید و در دسترس بودن مواد غذایی ضروری اصلی مانند نیتراتها,فسفاتها و سیلیکاتها وابسته است.

مراحل رشد فیتوپلانکتون ها:

 

1-مرحله تاخیر رشد:(Leg Phase)در این مرحله سلولها خود را با شرایط جدید تطبیق می دهد و اندازه سلولها به دلیل ساخت و تجمع موادروتوپلاسمی افزایش می یابداما تکثیر و ازذپدیاد سلولی مشاهده

نمی شود.

2-مرحله رشد انفجاری:(Exponential Growth Phase)

در این مرحله تعداد سلولها به سرعت و به صورت تصاعدی افزیش می یابد که نشان دهنده رشد و تکثیر مداوم سلولهاست.تداوم این مرحله به وجود شرایط محیطی مناسب نظیر شدت نور,درجه حرارت,فضای مناسب  وجود مواد مغذی کافی و.. بستگی دارد.

3-مرحله رشد بطئی:(Declining Growth Phase)

در این مرحله سرعت رشد سلولها به ارامی کند می شود و اگرچه هنوز وجود دارد ,ولی مانند مرحله قبل بصورت تصاعدی نیست.

4-مرحله سکون(Stationary Phase)

در این مرحله میزان جمعیت ثابت باقی می ماند که به معنی توازن بین مرگ و میر جلبکها وتکثیر سلولی است.بروز این مرحله ممکن است به دلیل کاهش مواد مغذی,تغییر شرایط محیطی نظیر pHو شدت نور و... خاصیت خودبازدارندگی ناشی از مواد سمی از خود سلولها باشد.

5-مرحله اضمحلال:(Death Phase)

مرگ ونابودی توده پلانکتونی عموما به دلیل عدم وجود مواد مغذی و مواد مترشحه سمی ناشی از خود جلبکها رخ می دهد.

روش های کشت فیتوپلانکتون ها :

روش های کشت پلانکتون ها دو نوع بوده که عبارتد از :

1-indoor :روش ازمایشگاهی که در داخل اتاق فایکولب کشت داده می شود.که در مراحل اول از لوله های ازمایش 20-15 میلی لیتری برای کشت استارتر استفاده می شود و پس از گذشت 2-1 روز در داخل شیشه های سرم یا ارلن مایر 1 لیتری ریخته و استفاده می شود که در این محیط کاملا اسرلیزه بوده و ورود افراد متفرقه ممنوع می باشد و محیطی که نباید کوچکترین الودگی داشته باشد .

2-out door:روش کشت بیرون از ازمایشگاه فایکولب صورت میگیرد که حجم کشت از 20 تا 10 تن اب در داخل سالن سرپوشیده از ایرانیت شفاف برای حجم های انبوه استفاده می شود.

در ابزی پروری به کلیه گونه های دیاتومه و جلبک های تک سلولی که بعنوان غذا کاربرد دارندالگهای ریز (Micro Algae)گفته می شود.

 انواع جلبک های عمده ای که بعنوان غذای زنده در ابزی پروری مورد مصرف قرار می گیرد به شرح زیر است :

1-کلرلا (Chlorella Sp.) از جلبک های سبز می باشد که اندازه ای حدود 5 میکرون دارند و زیر میکروسکوپ بصورت بیضی متمایل به دایره مشخص است .از طریق تقسیم شدن تکثیر می یابند و سلولها بصورت انفرادی می باشند .بیشتر در محیط های اب شیرین و لب شور یافت می شود ولی قدرت تکثیر و رشد در محیط های شور نیز قرار دارند.

2-تتراسلمیسTetrasalmis Sp)):این جلبک از دسته جلبک های سبز است که به خاطر وجود 4 تاژک بلند در یک طرف سلول بنام تتراسلمیس نامیده می شود .اندازه ان حدود 20 تا 30 میکرون است و بدلیل وجود تاژکها همیشه در محیط ابی  متحرک است و مانند یک زئوپلانکتون فعال در زیر میکروسکوپ نوری حرکت ان قابل مشاهده است . از طریق تقسیم شدن تکثیر می یابد و سلولها بصورت انفرادی بوده بیشتر انها ددر اب های شیرین و لب شور یافت می شوند ولی قدرت تکثیر و رشد در اب های شور نیز دارند.

3-نانوکلروپسیس(Nannochloropsis oculata):این جلبک از دسته جلبک های سبز است که دارای مقدار نسبتا زیادی اسید چرب ایکوزاپنتانوئیک اسید (EPA)و اسید چرب دکوزاهگزانوئیک اسید (DHA) می باشد.

4-اسکلوتنما(Skeletonema Sp.):این از جلبک های قهوه ای یا دیاتومه هاست که سلول های ان دارای 2 کلروپلاست و به شکل چهار گوش می باشد .اندازه سلولها 15-7 میکر.ن است که بصورت زنجیره به دنبال هم قرار گرفته اند و طول این زنجیرها ممکن است تا 15 عدد سلول نیز برسد . از طریق قطعه قطعه شدن تکثیر می یاببند و در اب های شوریافت می شود .

5-کیتوسروس (Cheatoserous Sp.):این جلبک نیز از دسته جلبک های قهوه ای یا دیاتومه هاست که سلولها بصورت چهار گوش متمایل به بیضی می باشد در هر گوشه ان تاژک کوتاهی وجود دارد .اندازه سلول 10 تا 20 میکرون است از طریق تقسیم شدن تکثیر می یابد و سلولها بصورت انفرادی می باشند و در اب های شور یافت می شوند.

 

 

 

 

فعالیت های ازمایشگاهی:

-نمونه برداری و نگهداری فیتوپلانکتون ها

2-1نمونه برداری و تثبیت نمونه ها در ازمایشگاه :

نمونه بردای فیتوپلانکتون ها از اب های دریایی با استفاده از انواع تورهایی انجام می شودکه از طریق انها حجم زیادی از اب فیلتر می شود تا تراکم انها زیاد شود. تور پلانکتونی شامل کیسه ی مخروطی است که دارای یک حلقه فلزی در انتهای دهانه و یک بطری جمع اوری پلانکتون در انتها است. جنس تورها متفاوت واز مواد مختلفی مانند ابریشم,پلی استر,نایلون و ...است.حداکثر به دام افتادگی فیتوپلانکتون ها در تور کمتر از 20 میکرون است.

بسته به درشتی چشمه تورهای صافی انواعی از مواد نایلونی غیرفیلامنی استفاده می شود. اگرعمق اب 3-2 متر بود از لوله پولیکا جهت نمونه برداری استفاده می شود .قطر دهانه به اندازه کف دست و طول 2-1 متر درون اب فرو می بریم و دست را روی ان قرار می دهیم و به طرف بالا کشیده می شود.

در صورتی که عمق اب بیشتر از 3 متر باشد از وسیله ای به نام روتنر استفاده می شود .وسیله ای با حجم متفاوت که توسط messenger دهانه ی ان بسته می شود و به عمق مورد نظر فرستاده می شود, سپس بالا کشیده شده و نمونه برداری صورت می گیرد.

در صورتی که عمق اب از 200 متر بیشتر باشد از وسیله ای به نام روزت جهت نمونه برداری استفاده می شود.

در صورتی که عمق اب کمتر از1 متر باشد می توان از سطل های پلاستیکی برای

 نمونه برداری استفاده کرد.

علاوه بر این باید فاکتورهای فیزیکوشیمیایی اب مانند Ph , دما ,هدایت الکتریکی وشوری توسط CTD اندازه گیری می شود.

مواد تثبیت کننده نمونه های پلانکتونی

فرمالین :

این ماده یک تثبیت کننده و نگهدارنده موثر برای نگهداری از انواع مختلفی از ارگانیسم ها از جمله پلانکتون ها به حساب می اید. فرمالین معمولا با فلز واکنش می دهد از اینرو همیشه در شیشه و یا مخازن پلاستیکی نگهداری می کنند و در درجه حرارت خنک نگهداری می شوند در صورتی که این ماده در بطری های رنگی نگهداری شود و در معرض نور قرار گیرد ماده ای سمی و سفیدرنگی بوجود می اید که دلیل ان تشکیل پارافرادئید می باشد .

ما در ازمایشگاه از محلول فرمالین 10 درصد (40-30سی سی)به منظور فیکس نمودن نمونه  استفاده نمودیم.

مرحله 1:جمع اوری و تغلیظ

در این مرحله ,جمع اوری و تغلیظ پلانکتون به منظور دستیابی به نمونه ای از حجم معینی از اب صورت

 می گیردبرای تغلیظ کردن نمونه مورد نظر از یک لوله پولیکا که به انتهای ان فیلتر صافی47 /0 میکرون و یک تور پلانکتونی 20 میکرون متصل است استفاده می کنیم به این صورت که نمنه اب مورد نظر را درون سطل ریخته و لوله پولیکای متصل به تور پلانکتونی وفیلتر صافی را درون اب قرار می دهیم اب فاقد پلانکتون درون لوله جمع می شود که ان را تخلیه کرده و باقیمانده اب که در زیر لوله است را برای نمونه برداری مورد استفاده قرار می دهیم.

 

 

 

کشت پلانکتون:

پرورش فیتوپلانکتون ها شامل مراحل مختلفی می شود که عبارتد از :

الف)انتخاب محفظه ی مناسب و استرلیزه کردن انها

ب)فورمالسیون و اماده سازی محیط کشت مناسب

ج)تفکیک گونه های مطوب برای تکثیر

د)پرورش در ازمایشگاه(پرورش در ظروف ازمایشگاهی و یا تانکرهای بزرگ تحت شرایط کنترل شده حرارتی,نوری,هوادهی

ه)تولید فیتوپلانکتون در مراحل مختلف رشد

الف)انتخاب محفظه های مناسب و استرلیزه کردن انها

ظروفی مانند لوله های ازمایش ,ظروف گرد,فلاتسک های مخروطی شکل یک لیتری فلاسک های گرد و تخت دو لیتری و شیشه ای 25 لیتری که همگی از جنس پیرکس یا شیشه کورنینگ می باشد ,برای پرورش فیتوپلانکتون ها بکار می روند ,برای تولیدات انبوه فیتوپلانکتون ها از سیلندرهای شیشه ای که در انتهای انها مجرایی برای تخلیه دمحیط کشت وجود داشته و مخازن دایره ای شکل (5000 لیتری)با انتهای شیب دار به سمت مرکز و مخزن های بتونی استفاده می شوند. برای این ظروف نیاز به هوادهی قوی است.ظروفی که برای پرورش استفاده می شوند را در ابتدا با اسیدسولفوریک کلرات شستشو داده و با اب مقطر اب می کشند .